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《抗菌塑料抗菌性能試驗方法及抗菌效果》JIS Z 2801


編輯:2022-01-20 10:51:56

引言
本標準是為規范抗菌制品抗菌性能的評價方法制定的,并于1998年12月在“生活相關新型(抗菌)功能制品會議”的報告上公布的,(亦稱“抗菌制品的指導方針”)。本標準規定了作為抗菌制品重要性能之一的抗菌性能的測試方法??咕破返钠渌匾阅?,包括安全性、性能持久以及制品標識則請參考“抗菌制品的指導方針”。

1. 范圍
本標準規定了抗菌制品(包括中間制品)表面抗細菌活性及效果的測試方法。
備注:本標準暫不包括抗菌制品的其他功能,如抗真菌性能和除臭性能。

2. 規范性引用標準
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是不注日期的引用文件,其新版本適用于本標準。
JIS K 0950 滅菌塑料培養皿
JIS K 0970 微量移液器
JIS K 3800 二級生物安全柜
JIS K 8101 乙醇(99.5)
JIS K 8150 氯化鈉
JIS K 8180 鹽酸
JIS K 8263 瓊脂
JIS K 8576 氫氧化鈉
JIS K 9007 磷酸二氫鉀
JIS K 9017 磷酸氫二鉀
JIS L 1902 紡織品抗菌性能的檢測與評價
JIS R 3505 玻璃量具

3. 定義
本標準中用到的主要術語定義如下:
a)抗菌 抑制制品表面細菌生長的狀態。
b)抗菌整理 為獲得抗菌效果而進行的處理。
c)抗菌制品 實施抗菌加工后的制品。
d)抗菌活性值 抗菌制品和未處理制品在接種細菌培養后,得到活菌數目對數的差值。
參考資料:JIS L 1902的抑菌(靜菌)活性和本標準中的抗菌活性概念相同。
e)抗菌效果 根據抗菌活性值判定抗菌制品抗菌效果。

4.抗菌效果
按本標準的測試方法,抗菌制品的抗菌活性值應不小于2.0,超過2.0的數值若取得各相關單位同意也可采用。

5.試驗方法
5.1 紡織制品測試方法  抗菌紡織制品的檢測方法根據JIS L 1902 : 8(定量法)測定
5.2 塑料等制品的測試方法  適用于非紡織制品,如塑料制品、金屬制品、陶瓷制品等。根據纖維制品的形狀和用途也可采用5.1 的方法測試。
5.2.1 試驗菌種
試驗所采用的菌種見下,需采用下述細菌中的每一種:
a) 金黃色葡萄球菌
b) 大腸桿菌
試驗所用菌株舉例如表1所示。如從有別于表1的機構獲取菌株,則該機構必須是國際菌種保藏中心(WFCC: World Federation of Culture Collection)的成員或日本菌種保藏協會(JSCC:Japan  Society of Culture Collection)的成員,并且菌株必須和表1相同。
表1 試驗所用的菌株

細菌種類

菌株號

保藏機構

金黃色葡萄球菌

ATCC6538P
FDA209P
IFO    12732

美國菌種保藏中心
美國食品藥品監管局(FDA)
發酵研究所

大腸桿菌

ATCC    8739
IFO    3972

美國菌種保藏中心
發酵研究所

5.2.2 化學試劑、材料和器材
除非另有說明,本試驗方法所用的化學試劑、材料和器材如下所示。
乙醇(C2H5OH)   符合JIS K 8012規定的一級或更高
牛肉膏           微生物試驗用
蛋白胨           微生物試驗用
氯化鈉           符合JIS K 8150
純化水           符合日本藥典第十三次修訂版要求
瓊脂             符合JIS K 8263
酵母浸膏         微生物試驗用
胰蛋白胨         微生物試驗用
葡萄糖           微生物試驗用
酪蛋白胨         微生物試驗用
大豆蛋白胨       微生物試驗用
卵磷脂           微生物試驗用
非離子表面活性劑 聚山梨醇脂(吐溫80)
磷酸二氫鉀       符合JIS K 9007
磷酸氫二鉀       符合JIS K 9017
氫氧化鈉         符合JIS K 8576
鹽酸             符合JIS K 8180
棉塞等           棉制,或硅膠、金屬、莫頓塞等
白金接種環       端部直徑約為4mm環
干熱滅菌器       可在160-180℃工作
蒸氣消毒鍋       可保持121℃并在103KMPa保壓
安全柜           符合JIS K 3800的規定
潔凈臺           微生物試驗用
移液管           符合或等同于JIS K 0970 或達到JIS R 3505中規定的A級
培養箱           溫度控制精度±1℃
培養皿           玻璃材質,內直徑90mm或遵照JIS K 0950中90A或90B規定
洗脫袋           微生物試驗用
Stomacher         微生物試驗用
薄膜             不影響微生物生長并且不吸水的材料,厚度無明確規定,但要求附著性好

5.2.3 滅菌方法
a) 干熱滅菌   放入干熱滅菌器在160-180℃下滅菌30-60分鐘
注意:滅菌后,如果棉塞或包裝紙不小心被水弄濕,相關器皿請不要繼續使用。
b) 高壓蒸汽滅菌  在滅菌消毒鍋中注入水,將待滅菌的物品裝入筐中,并放于消毒鍋架子上,蓋緊,加熱,在121℃或103Kpa下保持15-20分鐘。停止加熱,然后使其自然冷卻到100℃以下,打開排氣閥放出蒸汽,打開蓋,取出滅菌物品。必要時放入潔凈臺或安全柜中冷卻。為避免滅菌鍋受培養物質或化學品污染,用中性洗滌劑洗滌滅菌鍋,并用水沖洗干凈。
c) 火焰滅菌 將待滅菌的物品置于由燃氣或酒精燃燒而產生的火焰上,如對于白金接種環應加至紅熱,對于試管則在火焰上烤2-3秒鐘。
d) 器材準備 用堿性或中性洗滌劑洗刷試管、燒瓶等器具,充分沖洗,干燥后干熱滅菌或蒸汽滅菌后使用。

5.2.4 培養基等
使用下列培養基,如商品培養基和此處介紹的培養基組成相同,則也可使用商品培養基。
a)營養肉湯  將3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化鈉溶于1000ml蒸餾水或去離子水中,放入錐瓶、混合、充分溶解后,用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節其pH為7.0-7.2(25℃),使用前,將其分別注入試管,加上棉塞,然后進行高壓滅菌。
若配好后不立即使用,要在5℃~10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養基。
b)營養瓊脂  將5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化鈉和15.0g瓊脂,加入1000ml蒸餾水或去離子水中,置入錐瓶、混合并放入沸水浴中充分溶解。用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節其pH為7.0-7.2(25℃),加上棉塞,然后進行高壓滅菌。
若配好后不立即使用,要在5℃~10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養基。
c)平板計數瓊脂  將2.5g酵母粉、5.0g胰蛋白胨、1.0g葡萄糖和15g瓊脂加入到1000ml蒸餾水或去離子水中,置于錐瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH為7.0-7.2(25℃),加上棉塞,然后進行高壓滅菌。
若配好后不立即使用,要在5℃~10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的培養基。
d)斜面培養基  將6-10ml加熱溶解的營養瓊脂b)注入試管,塞上棉塞并用高壓蒸汽法滅菌。滅菌后的試管在潔凈間中以和水平面成15°傾角放置來讓其凝固。若配好后不立即使用,要在5℃~10℃下保存。如沒有冷凝水出現,將其溶解,并凝固后使用。不要使用配制完存放一個月或以上的斜面培養基。
e)SCDLP肉湯  將17.0g酪蛋白胨、3.0g大豆蛋白胨、5.0g氯化鈉和2.5g磷酸氫二鈉、2.5g葡萄糖和1.0g卵磷脂加入到1000ml蒸餾水或去離子水中,置于燒瓶,加7.0g非離子表面活性劑以促進溶解。用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節其pH為6.8-7.2(25℃).使用此培養基時,將其分散到試管中或燒瓶中,將棉塞塞上,然后用高壓濕熱法滅菌。
若配好后不立即使用,要在5℃~10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的SCDLP肉湯。
f)磷酸鹽緩沖溶液  將34.0g磷酸二氫鉀放入容量瓶中,加入500ml蒸餾水或去離子水已將其充分溶解,用氫氧化鈉溶液調節其pH為6.8-7.2(25℃),然后加入蒸餾水或去離子水將溶液定容到1000ml。使用時,取部分溶液到試管或燒瓶中,塞上棉塞,并加入7.0g非離子表面活性劑。用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節其pH為6.8-7.2(25℃)。使用此溶液時,將其分裝至試管或燒瓶中,塞上棉塞,然后用高壓濕熱法滅菌。
若配好后不立即使用,要在5℃~10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的磷酸鹽緩沖溶液。
g)磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液
用濃度為0.85%的氯化鈉溶液稀釋磷酸鹽緩沖溶液至體積比800倍。當使用此溶液時將其分裝至試管或燒瓶中,塞上棉塞,然后用高壓濕熱法滅菌。若配好后不立即使用,要在5℃~10℃下保存。不要使用配制完存放一個月或以上的磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液。

5.2.5 細菌的保藏 在無菌條件下轉接試驗細菌,必要時要使用生物安全柜。一手同時拿著保藏菌和5.2.4 d)的待接種斜面培養基,另一手拿接種環,并用拿接種環的手拔開試管的橡膠塞。在火焰上對試管口滅菌,并對接種環滅菌,然后將接種環的頭部放入斜面培養基的冷凝水中冷卻。用接種環從細菌生長面上刮下細菌,并用劃線法接種到斜面培養基上。用火焰再次對試管口部進行消毒并塞上棉塞。用火焰對接種環進行消毒。在35±1℃下對接種后的斜面進行24-48小時培養,然后在5-10℃保藏。一個月內將其接種到新的斜面(以此類推),但接種次數從菌種中心得到的細菌算起不應超過10代。如保存時間達到或超過一個月,不可進行繼代培養。


備注:如圖1將接種環端部插入冷凝水中分散細菌,用接種環從底部拉一條線到上部,或將接種環再次插入到冷凝水中畫一條折線到頂端。
注意:如細菌保藏機關提供的細菌經過凍干法或冷凍法用于長時間保存,從原始保存菌制備保藏細菌的次數也應包括在細菌培養代數之內。
如使用此保藏菌株,則其繼代培養次數不應超過10減去保藏菌的代數。

5.2.6 試驗操作 細菌操作必須在無菌條件下進行,試驗菌注意不能對試驗操作人員、設備和環境構成污染,如有需要則使用生物安全柜。
a)細菌前培養 用接種環從5.2.5的保藏細菌的培養基中取1環細菌接種到5.2. 4 d)的斜面培養基上,35±1℃條件下培養16-24小時。從這一培養物上,再取一環細菌到新的斜面培養基上,35±1℃條件下培養16-20小時。
b)樣片準備 從制品上切取邊長為50±2mm,厚度不大于10mm[3]的方塊,作為標準樣片??瞻讓φ諛覽4]6塊[5]、抗菌樣片3塊。如不能得到空白對照樣,則利用5.2.2的薄膜。密切注意樣片和樣片制備過程中的微生物污染以及制品的污物污染。盡量從制品上采集樣片,如由于制品的形狀的原因不能從制品采集樣片,則利用相同的原料和工藝單獨制備樣片。
備注:
[3]如難以或不能將制品切成50±2mm,厚度不大于10mm的方塊,也可采用非標準形狀和尺寸的樣片,這一樣片應該可以在其上覆蓋400-1600mm2的薄膜。
[4]從空白樣或薄膜制得的樣片。
[5]6個未抗菌處理樣片中,3個用于接種后零時間記數,另外3個用于接種后培養24小時后記數。
c)樣片清洗 用紗布或脫脂棉蘸酒精輕輕擦拭b)中樣片2-3次,并干燥徹底。若上述處理會導致樣片軟化、樣片表面涂層溶解及組分溶出等現象,則認為此種處理將影響試驗結果,可采用其他方法處理或直接試驗而不進行任何處理。
d)接種菌液的制備  將5.2.4 a)的營養肉湯稀釋500倍,用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調節pH至6.8-7.2,然后高壓滅菌,作為1/500NB。將a)中的前培養物取1環均勻分散到少量的1/500NB中,采用顯微鏡觀察法或其它合適的方法估計細菌數目,并用1/500NB稀釋菌液至細菌濃度為(2.5~10)×105cfu/ml,以此作為試驗用菌液。若菌液不立即使用,將其冷凍至0℃,保存時間不超過4小時。
e)試驗菌液的接種 將c)中的樣片放入滅菌培養皿中,保持試驗面朝上[6] ,用移液管[7] 準確量取d)中的菌液0.4ml,緩慢滴到每個樣片表面。并將薄膜蓋于菌液上,調節薄膜使菌液分散到整個薄膜,注意不要使菌液從薄膜邊溢出,然后蓋上培養皿的上蓋。
備注:
[6] 試驗面必須為制品的抗菌加工面,即使抗菌加工達到制品的一定深度,也不能采用制品的橫切面。
[7] 若采用標準尺寸以外的樣片,則所加菌液量根據該樣片所用薄膜的尺寸按比例減少。即使對于符合標準尺寸的樣片,如按規定量接種時,由于某些材料如陶瓷、玻璃、瓷磚、搪瓷等的親水性好,難免因培養皿稍微傾斜而導致培養液流出。此種情況下,接種菌液量減為規定菌液量的1/4。但即使菌液量減少也要保證每片上的細菌數為(1.0-4.0)×105cfu/ml,此種情況下,d)中規定的菌液濃度不能滿足要求,而必須根據具體要求配制。
[8]薄膜的標準尺寸為40±2mm。若樣片為非標準尺寸,則調整薄膜尺寸,以使薄膜邊緣距樣片邊緣2.5mm以上,但薄膜尺寸不應小于400mm2。在制品由于形狀難以將薄膜密著于樣片表面,以及由于表面吸水或親水,不使用薄膜菌液也可在樣片表面鋪展這二種情況下可不用薄膜。
f)接種后樣片的培養 將接種后放置3個抗菌樣片和3個空白無加工樣片的培養皿,在35±1℃相對濕度不小于90%的條件下培養24小時。
參考資料:此時制品的抗菌性能是在該培養溫度下的抗菌活性值,但也可同時考慮抗菌材料的使用溫度(如室溫)下的抗菌性能。
g)培養后樣片的洗脫
1)0接觸時間的樣片的洗脫[9] 對3個0接觸時間的空白對照樣,將覆蓋膜和樣片用鑷子小心放入Stomacher袋以防止菌液損失,用移液管取5.2.4 e)中10ml SCDLP加入到Stomacher袋中,并用手或分離器充分搓揉樣片和薄膜。洗脫后馬上對洗脫液進行活菌計數。
2)培養后試驗片的洗脫[9]   對f)中的培養后樣片的洗脫采用類似1)的方法進行,之后馬上對洗脫液進行活菌計數。
[9] 對于細菌洗脫,如有其他方法效果與此種方法相當或優于此方法,也可采用。如因為樣片尺寸以及其他性能方面的原因,用10ml SCDLP難以洗脫,也可增加SCDLP用量。
h)傾注活菌計數法 用移液管準確量取g)的洗脫液1ml,放于裝有9.0ml 5.2.4  g)中的磷酸鹽生理鹽水緩沖液的試管中,充分混勻。用新的移液管從中量取1ml到另一支試管中并混勻。重復上述10倍梯度稀釋過程。從洗脫液及其稀釋液中分別取1ml,各放入2個滅菌培養皿中,向各培養皿中傾入15-20ml溫度為46-48℃的5.2.4 c)中的平板計數瓊脂,與菌液混和充分。蓋上上蓋,允許在室溫放置。待瓊脂凝固后將培養皿翻轉,并在35±1℃培養40-48小時。培養后,計算菌落數為30-300的培養皿,若1ml洗脫液中的細菌數小于30,則對該培養皿直接計數。如任何培養皿中均沒有菌落,則記錄為<1。如果細菌數和稀釋比例不成反比,則要考慮由于抗菌劑的作用而影響了菌落的形成,這樣就需要使用中和劑或稀釋等方法使抗菌劑不對菌落形成產生影響的方法來培養計數。
參考資料:本規定以外采集的菌落數的計算方法,可參考日本藥學會編的衛生試驗法注解(2000)1.2微生物試驗法3)菌數測定(1)傾注平板試驗法,或衛生福利部生活衛生局監制修訂的食品安全規則的2有害指示菌1.標準分析方法中的總菌數測定。

5.2.7  活菌數計算
根據式(1),由菌落計數的得到活菌數。
N=C×D×V                                                           (1)
其中  N:每樣片的活菌數
C:菌落數(2個培養皿的平均值)
D:稀釋倍數
V:用于洗脫的SCDLP培養液的體積(ml)
記錄活菌數時取二位有效數字,第三位有效數字四舍五入。在V=10的情況下,對菌落數小于1的情況記為小于10。取活菌數的平均值時,對三個試驗片的活菌數取算術平均值,結果保留二位有效數字,第三位有效數字四舍五入。當活菌數為小于10時,此數作為10 進行平均值計算。

5.2.8 試驗結果
a)試驗成立條件的判定  當下述三個條件都得到滿足時,試驗被判定有效。反之,則試驗無效,須重新進行試驗。

    1. 空白對照樣片零接觸時間的活菌數滿足如下條件:

(L最大- L最?。? L平均≤0.2
其中:L最大—活菌數的最大對數值
L最大—活菌數的最小對數值
L平均—三個樣片的活菌數對數的平均值

    1. 零接觸時間空白對照樣的活菌平均值應為(1.0-4.0)×105個。

    2. 三個空白對照樣經24小時培養后的活菌數均不能小于1.0×103個。當空白對照樣上覆蓋薄膜時,三個樣品培養后的活菌數均不能小于1.0×104個。

b)抗菌活性值計算  試驗成立條件下,根據式(2)計算抗菌活性值,保留小數點后一位有效數字,對小數點后的第二位有效數字四舍五入。
R=[log(B/A)- log(C/A)]=  [log(B/C)]                                        (2)
其中: R-抗菌活性值

  1. 空白對照樣0接觸時間活菌數平均值

  2. 空白對照樣24小時培養后活菌數平均值

  3. 抗菌加工樣片24小時培養后活菌數平均值

6  試驗結果記錄
6.1 紡織制品  記錄試驗細菌種類、細菌保藏號、接種菌液濃度(接種菌液中所含的細菌數)、抗菌活性(抑菌活性)、樣片種類等。如在接種液中加入了非離子表面活性劑,則須記錄其名稱和濃度。
6.2 塑料制品  記錄空白對照和抗菌處理樣片的種類、尺寸、形狀、厚度、薄膜厚度、細菌種類、保藏號、接種用菌液的體積、試驗菌液中的活菌數、5.2.8中的A、B、C值以及抗菌活性值等。

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